Антибіотикорезистентність – серйозний виклик у боротьбі та профілактиці хвороб, викликаних патогенними бактеріями. Безконтрольне використання антибіотиків і відсутність своєчасної регуляції їхнього застосування призвели до того, що все більше й більше бактерій набувають стійкості до багатьох видів антибіотиків, що може знівелювати їхню ефективність у майбутньому й призвести до понад 5 мільйонів смертей від бактеріальних хвороб та їхніх ускладнень у світі щороку й 10 мільйонів на рік – до 2050 року. Поза цим, як і будь-які живі організми, бактерії перебувають під постійним тиском природного добору й мають свої патогени, серед яких головну роль відіграють віруси – бактеріофаги. Вони є природними регуляторами чисельності бактерій, а відтак – перспективними агентами біоконтролю над ними й можливо, тією «срібною кулею», що допоможе людству впоратися із бактеріальними хворобами, використавши проти бактерій їхніх природних ворогів.
Віруси бактерій, бактеріофаги – велика група переважно ДНК-вмісних вірусів, що є специфічними паразитами бактерій. Через тривалу коеволюцію із організмами-господарями, бактеріофаги набули здатності уникати й протистояти дії бактеріальних захисних систем, що робить їх перспективною якщо не заміною, то альтернативою антибіотикам із фактично необмеженими можливостями біотехнологічних модифікацій їхніх властивостей для покращення ефективності, що не йде в порівняння із обмеженнями, які накладає на антибіотики їхня складна хімічна будова й собівартість створення препаратів нового покоління.
Перші відомості про бактеріофаги з’явилися наприкінці ХІХ століття. В 1896 році британський бактеріолог Ернест Ханкін помітив, що води ріки Ганг мають бактерицидну дію, яка зникає після кип’ятіння. В 1915 році Фредерік Туорт описав біологічний агент, що уражував культури Staphylococcus aureus і викликав лізис бактеріального газону з утворенням негативних колоній-бляшок. Знайомий із роботами Дмитра Івановського, він припустив, що виділений агент мав вірусну природу. В 1917 році Фелікс д’Ерель назвав невідомий агент «бактеріофагом», що у перекладі з грецької означало «пожирач бактерій». Усвідомлюючи значимість відкриття та можливості прикладного застосування бактеріофагів, д’Ерель почав використовувати їх для лікування кишкових хвороб. Його праця довела ефективність фагів і наукові роботи, пов’язані з вірусами бактерій, почали з’являтися у медичних журналах.
Ернест Ханкін (ліворуч), Фредерік Туорт (по центру) та Фелікс д’Ерель (праворуч) – «батьки-засновники» напрямку фаготерапії та перші вчені, які застосовували бактеріофаги для лікування хвороб.
Із появою електронного мікроскопу в 1931 році і впровадженню методу електронної мікроскопії у вірусологію в 1939 році вдалося візуалізувати віруси бактерій і довести їх приналежність до вірусів, а не до токсинів. Перші електронно-мікроскопічні дослідження показали, що бактеріофаги – це гетерогенна група вірусів з різноманітними за формою, розмірами та структурою віріонами, що лягло в основу першої систематики бактеріофагів і здавалося, як фундаментальні, так і прикладні аспекти вивчення бактеріофагів от-от відкриють нову віху в історії медицина, але…
Електронно-мікроскопічне зображення бактеріофагу:
- Голівка ікосаедричного типу симетрії (вмістилище геному) (1),
- Хвостовий відросток та його компоненти (2) – конектор (а), чохол (б), базальна пластинка (в) та термінальні фібрили (г).
В 1943 році Александр Флемінг випускає в сирійне виробництво пеніцилін і успіхи антибіотикотерапії відсувають подальший розвиток фаготерапії на другий план. Починається битва фармацевтів за впровадження нових і нових видів антибіотиків (1945 рік – тетрацикліни, 1947 рік - нітрофурани, 1952 рік – макроліди) і розпочинається золота ера антибіотикотерапії. Але вже в 1947 році з’явилися повідомлення, що деякі види бактерій втратили чутливість до пеніциліну, а проти інших його ефективність значно знизилася. Це стало першим подзвіном для вчених і медиків, які вважали що ері бактеріальних хвороб от-от прийде кінець і людство позбудеться їх, як от-от мало позбутися віспи, дякуючи вакцинації.
Бактерії повільно набували стійкості до пеніциліну, пізніше – до тетрицикліну, ще пізніше – до макролідів та інших антибіотиків і вже в 80-ті та 90-ті роки ХХ століття стало зрозуміло, що антибіотики не вирішать проблеми бактеріозів і варто розширювати спектр протибактеріальних препаратів, позаяк клінічно-значимі види мікроорганізмів набували стійкості не до однієї групи препаратів, а одразу до декількох, а то й 3 і 4, серед яких найбільше занепокоєння викликали метицилін-резистентні штами Staphylococcus aureus, карбапенем-резистентні штами Klebsiella pneumoniae, ріфампіцин-резистентні штами Mycobacterium tuberculosis.
У той же час бактеріофаги продовжували вивчати й застосовувати, але не так широко, як антибіотики. На той момент віруси були доволі складною групою для вивчення й багато механізмів їхньої взаємодії із господарями були не відомими. Однією із цих «ранніх» загадок був механізм дії бактеріофагів: чому в одних випадках вони допомагали, а в інших – ні, або призводили до ще гіршої клінічної картини, ніж була напередодні. Що Ернест Ханкін, що Фелік д’Ерель застосовували віруси в лікуванні кишкових інфекцій, але результати терапії були неоднозначні – одні пацієнти одужували, а інші отримували важчу форму інфекції, що подекуди призводила до їхньої загибелі. Лише в 90-х роках експерименти Сальвадора Лурії пролили світло на те, які життєві цикли мають віруси бактерій і як це можна пов’язати із їхньою ефективністю в якості протибактеріальних агентів.
Бактеріофагам притаманно два основні типи взаємодії із бактеріями:
- Літичний – вірус проникає в клітину й руйнує її внаслідок свого розмноження. Подібні віруси вважаються найбільш перспективними в якості протибактеріальних агентів.
- Лізогенний – бактеріфаг проникає в клітину бактерії й залежно від її метаболічного стану – або знищує її внаслідок продуктивної інфекції (коли бактерія метаболічно-активна), або інтегрується в її геном аби перечекати несприятливі умови існування бактерії, щоби потім знищити якусь частину дочірніх інфікованих клітин, яким вірус передаватиметься у складі материнської ДНК.
Ці два типи взаємодії є найпоширенішими. Зважаючи на тип взаємодії, найбільший інтерес викликають саме літичні віруси, позаяк вони призводять до практично повної елімінації бактерії. Та є й «але»: літичні фаги можуть уражувати тільки ті клітини, які перебувають на стадії активного росту, в яких активні реплікативні системи. В іншому випадку інфікування може закінчитися абортуванням і відсутністю вірусного потомства. Відтак літичні фаги добре працюють коли бактерії розмножуються й гірше – коли колонія досягла стадії плато. Це важливий момент, втім, не варто забувати що й антибіотики працюють аналогічним чином – вони ефективні тільки тоді, коли в клітині є білки-мішені – інгібітори синтезу клітинних стінок, як ті ж β-лактами, не зможуть інгібувати їх синтез якщо не активні DD-транспептидази; блокатори ДНК-гіраз і топоізомераз фторхінолони – коли немає їхніх мішеней, а є вони в бактеріях на стадії розмноження.
Та стаціонарний період розвитку бактерій – не завада для лізогенних (помірних) бактеріофагів, які здатні інтегруватися в їхні геноми й перечекати там до активації клітинного циклу або ж необмежено довго передаватися всім дочірнім клітинам бактерії, реплікуючись у складі їхніх геномів. По суті лізогенні бактеріофаги – генетичні бомби уповільненої дії, що чекають слушного моменту, аби знищити уражену популяцію чи її частину. Проблема їхнього застосування в якості антимікробних агентів полягає в тому, що вихід бактеріофагу з геному потребує індукції, як правило – гострого клітинного стресу. Таким стресом може стати взаємодія з антибіотиками (тими ж фторхінолонами чи макролідами) або чинниками середовища (радіація, інсоляція, прогрівання), що загрожують існуванню клітини й відтак, вірусу. За таких умов вірус активується й руйнує всі клітини, в яких був. Але головна проблема – не індукція, а те, що інтегровані в геном бактеріфаги, що звуться профагами, є джерелом стійкості таких бактерій-хазяїв до інших вірусів (через системи попередження суперінфекції) а ще – чинниками вірулентності, позаяк саме інфікування вірусом перетворює апатогенний штам бактерії в патогенний.
Деякі бактеріофаги містять у своїх геномах гени субодиниць токсинів, здебільшого – генів А-субодиниці, але деякі бактеріофаги, такі як CTXφ Vibrio cholerae, фаг С1 Clostridium botulinum, фаг H-19B Escherichia coli містять цілі кластери токсинів. Для вірусу зміна поведінки господаря й здатність бактерії займати нові екологічні ніші означають появу більшої кількості пермісивних клітин, а відтак – більші шанси на відтворення, що спричиняє проблему, пов’язану із зростанням агресивності й вірулентності бактерій.
Зважаючи на це, коли мова заходить про розробку й впровадження препаратів на основі бактеріофагів, з’являються серйозні вимоги щодо того, які віруси використовувати й чи будуть ці препарати безпечними. Відповідь – будуть, позаяк на теперішньому етапі розвитку біотехнологій і діагностичних систем творці цих препаратів можуть відслідковувати небезпечні кластери генів.
Сучасні препарати бактеріофагів – це суміші кількох різних вірусів, специфічних або до конкретного збудника (моновалентні), або до групи збудників (полівалентні). Найкращим кандидатом на роль агента фаготерапії є літичний полівалентний вірус із значною швидкістю відтворення та адаптивністю до змін господаря. Отримати такий можна двома способами – шляхом довільного підбору бактеріофага із існуючої колекції ізолятів або ж шляхом прямого виділення бактеріофагу із популяції бактерії-господаря. Унікальність бактеріофагів зумовлена тим, що вони завжди представлені в місцях мешкання своїх господарів. Задача біотехнолога/вірусолога/мікробіолога – виділити вірус і дослідити його на безпечність, а саме:
- Здатність лізувати/лізогенізувати бактерію;
- Відсутність генів токсинів/їх субодиниць у геномі;
- Відсутність інших шкодочинних генів (антибіотикорезистентності, фазової варіантивності);
- Здатність блокувати виділення ендотоксинів перед лізисом клітин.
В наш час перевірити це можна шляхом проведення аналізу ДНК вірусу на відомі маркери подібних груп генів. Якщо вірус не містить небезпечних генів, то його можна використовувати після лабораторного тестування. Важливим параметром при створенні фагових препаратів є стійкість вірусів, що впливає на термін зберігання коктейлю, адже мова йде про цілісні біологічні об’єкти, а не хімічні сполуки. Більшість бактеріофагів – дуже стійкі й виживають усюди, де мешкають їхні бактерії-господарі, не залежно від температури, рН та осмотичності середовища.
Важливою вимогою до композиції суміші є не надто велика кількість різних фагів, позаяк вони – ультраконкурентні віруси, що змагатимуться за бактерію-хазяїна, знищуючи один одного, а не збудника хвороби. Також ці віруси повинні долати системи захисту, створеними інтегрованими в геном бактерій вірусами, інакше ефективність препарату буде низькою й не довготривалою.
Технологія отримання фагосумішей відпрацьована й існує багато сертифікованих виробництв подібних препаратів у різних країнах, включаючи Україну. Наразі фаготерапія переживає другий Ренесанс – напрям розвивається стрімко й щороку з’являються все нові й нові компанії, що пропонують суміші бактеріофагів, але це – тільки перший етап розвитку цього терапевтичного напрямку. Другий – біотехнологічно-модифіковані віруси, що по суті не є вірусами, а самовідтворюваними біопрепаратами: це бактеріофаги зі зміненими геномами, завдання яких – не відтворювати повноцінні віріони, а поширювати інфекційну ДНК у складі рецептор-зв’язуючих білкових тілець. Подібні химери вже тестують лабораторно й показують значну ефективність у протидії бактеріозам. Окрім цього – віруси слугують джерелом нових антибактеріальних речовин, що мають антибіотикоподібну активність, хоча по суті є вірусними білками, розмноженими в біореакторах. Сюди можна віднести лізоцими – ферменти (екзо- та ендомурамідази), що розчиняють клітинні стінки бактерій, а також протеїнові антибіотики – бактеріоцини, що інгібують синтез клітинних стінок бактерій, на кшталт пеніциліну, але за природою є низькомолекулярними пептидами (пептид Е у фагу φX174, L фагів MS2⁄GA, A2 фагів Qβ⁄SP). Третій шлях – поєднання бактеріофагів та антибіотиків для підсилення ефективності обох складових препарату чи когось одного.
Фаготерапія – «нова-стара» зброя проти бактеріозів, що активно розвивається й від того, як медична та наукова спільнота реагуватимуть на її розвиток залежатиме її успіх у різних країнах. Україні пощастило мати власні розробки фагових препаратів і замкнутий цикл виробництва, проте якщо ми хочемо конкурувати на ринку в майбутньому – маємо активніше розвивати цей напрям і не боятися бути в авангарді впровадження альтернативного методу лікування бактеріальних інфекцій, позаяк несвоєчасна реакція на інновації в цій галузі може призвести до втрати можливостей створення доробку власних наукових розробок та підтримання реноме науково реципієнта, яке стійко тримається вже декілька десятиліть. Фахівці центру лікування безпліддя «Medical Plaza» виступають за персоналізовану медицину, вітчизняні інноваційні розробки й підтримку української науково-технічної галузі. Тож ми активно застосовуємо й апробовуємо цю технологію в нашому центрі, пропонуємо нашим пацієнтам застосовувати бактеріофаги для комплексного лікування хронічних та гострих бактеріальних інфекцій, розширюємо технологічні можливості вітчизняних виробників, створюючи запит на нові фагові суміші та препарати. Все це дозволить Україні гідно конкурувати на ринку препаратів для боротьби з бактеріальними інфекціями та створювати тренди в цій галузі, а не рухатися тільки в фарватері світової науки та персоналізованої медицини.
ВИСНОВКИ: Фаготерапія – перспективний напрям боротьби лікування бактеріозів, що є альтернативою антибіотикотерапії, до якої у багатьох пацієнтів вже сформувалася резистентність. Екологічна й еволюційна лабільність вірусів дозволяє швидко підбирати нові види й компонувати нові фагові суміші, які можна застосовувати в різноманітних протоколах лікування. Можливість створення індивідуальних препаратів на основі вірусів дозволить значно розширити можливості персоналізованої медицини, що є вагомим кроком лікарської практики в ХХІ столітті.