Антибиотикорезистентность – серьезный вызов в борьбе и профилактике заболеваний, вызванных патогенными бактериями. Бесконтрольное использование антибиотиков и отсутствие своевременной регуляции их применения привели к тому, что все больше и больше бактерий приобретают устойчивость ко многим видам антибиотиков, что может нивелировать их эффективность в будущем и привести к более чем 5 миллионам смертей от бактериальных болезней и их осложнений в мире ежегодно. 10 миллионов в год – до 2050 года. Кроме того, как и любые живые организмы, бактерии находятся под постоянным давлением естественного отбора и имеют свои патогены, среди которых главную роль играют вирусы – бактериофаги. Они являются естественными регуляторами численности бактерий, а затем – перспективными агентами биоконтроля над ними и, возможно, тем «серебряным шаром», который поможет человечеству справиться с бактериальными болезнями, использовав против бактерий их природных врагов.
Вирусы бактерий, бактериофаги – большая группа преимущественно ДНК-содержащих вирусов, являющихся специфическими паразитами бактерий. Из-за длительной коэволюции с организмами-хозяевами, бактериофаги приобрели способность избегать и противостоять действию бактериальных защитных систем, что делает их перспективной если не заменой, то альтернативой антибиотикам с фактически неограниченными возможностями биотехнологических модификаций их свойств для улучшения эффективности, не сопоставимой с ограниченными. которые накладывает на антибиотики их сложное химическое строение и себестоимость создания препаратов нового поколения.
Первые сведения о бактериофагах появились в конце XIX века. В 1896 году британский бактериолог Эрнест Ханкин заметил, что воды реки Ганг оказывают бактерицидное действие, которое исчезает после кипячения. В 1915 году Фредерик Туорт описал биологический агент, поражавший культуры Staphylococcus aureus и вызвавший лизис бактериального газона с образованием отрицательных колоний-бляшек. Знакомый с работами Дмитрия Ивановского, он предположил, что выделенный агент обладал вирусной природой. В 1917 году Феликс д'Эрель назвал неизвестный агент «бактериофагом», что в переводе с греческого означало «пожиратель бактерий». Осознавая значимость открытия и возможности применения бактериофагов, д'Эрель начал использовать их для лечения кишечных болезней. Его труд доказал эффективность фагов и научные работы, связанные с вирусами бактерий, начали появляться в медицинских журналах.
Эрнест Ханкин (слева), Фредерик Туорт (по центру) и Феликс д'Эрель (справа) – «отцы-основатели» направления фаготерапии и первые ученые, применявшие бактериофаги для лечения болезней.
С появлением электронного микроскопа в 1931 г. и внедрению метода электронной микроскопии в вирусологию в 1939 г. удалось визуализировать вирусы бактерий и довести их принадлежность к вирусам, а не к токсинам. Первые электронно-микроскопические исследования показали, что бактериофаги – это гетерогенная группа вирусов с разнообразными по форме, размерам и структуре вирионами, что легло в основу первой систематики бактериофагов и казалось, как фундаментальные, так и прикладные аспекты изучения бактериофагов. истории медицина, но…
Электронно-микроскопическое изображение бактериофага.
- Головка икосаэдрического типа симметрии (вместилище генома)(1)
- Хвостовой отросток и его компоненты (2) – коннектор (а), чехол (б), базальная пластинка (в) и терминальные фибриллы (г).
В 1943 году Александр Флеминг выпускает в сирийное производство пенициллин и успехи антибиотикотерапии отодвигают дальнейшее развитие фаготерапии на второй план. Начинается битва фармацевтов за внедрение новых и новых видов антибиотиков (1945 – тетрациклины, 1947 – нитрофураны, 1952 – макролиды) и начинается золотая эра антибиотикотерапии. Но уже в 1947 году появились сообщения, что некоторые виды бактерий утратили чувствительность к пенициллину, а по сравнению с другими его эффективность значительно снизилась. Это стало первым подзвоном для ученых и медиков, считавших что эре бактериальных болезней вот-вот придет конец и человечество избавится от них, как вот-вот должно было избавиться от оспы, благодаря вакцинации.
Бактерии медленно приобретали устойчивость к пенициллину, позже – к тетрициклину, еще позже – к макролидам и другим антибиотикам и уже в 80-е и 90-е годы ХХ века стало понятно, что антибиотики не решат проблемы бактериозов и следует расширять спектр противобактериальных препаратов, поскольку клинически-значимые виды микроорганизмов приобретали устойчивость не к одной группе препаратов, а сразу к нескольким, а то и 3 и 4, среди которых наибольшее беспокойство вызывали метициллин-резистентные штаммы Staphylococcus aureus, карбапенем-резистентные штаммы Klebsiella pneu sis .
В то же время, бактериофаги продолжали изучать и применять, но не так широко, как антибиотики. На тот момент вирусы были довольно сложной группой для изучения и многие механизмы их взаимодействия с хозяевами были неизвестны. Одной из этих «ранних» загадок был механизм действия бактериофагов: почему в одних случаях они помогали, а в других нет, или приводили к еще худшей клинической картине, чем была накануне. Что Эрнест Ханкин, что Фелик д'Эрель применяли вирусы в лечении кишечных инфекций, но результаты терапии были неоднозначны – одни пациенты выздоравливали, а другие получали более тяжелую форму инфекции, которая иногда приводила к их гибели. Лишь в 90-х годах эксперименты Сальвадора Лурии пролили свет на то, какие жизненные циклы обладают вирусами бактерий и как это можно связать с их эффективностью в качестве противобактериальных агентов.
Бактериофагам присущи два основных типа взаимодействия с бактериями:
- Литический – вирус проникает в клетку и разрушает ее в результате своего размножения. Подобные вирусы считаются наиболее перспективными в качестве противобактериальных агентов.
- Лизогенный – бактерифаг проникает в клетку бактерии и в зависимости от ее метаболического состояния – либо уничтожает ее вследствие продуктивной инфекции (когда бактерия метаболически активная), либо интегрируется в ее геном чтобы переждать неблагоприятные условия существования бактерии, чтобы затем уничтожить какую-то часть дочерних инфиц. вирус будет передаваться в составе материнской ДНК.
Эти два типа взаимодействия наиболее распространены. Ввиду типа взаимодействия наибольший интерес вызывают именно литические вирусы, так как они приводят к практически полной элиминации бактерии. Но есть и «но»: литические фаги могут поражать только те клетки, которые находятся в стадии активного роста, в которых активны репликативные системы. В противном случае инфицирование может окончиться абортированием и отсутствием вирусного потомства. Следовательно, литические фаги хорошо работают, когда бактерии размножаются и хуже – когда колония достигла стадии плато. Это важный момент, впрочем, не стоит забывать, что и антибиотики работают аналогичным образом – они эффективны только тогда, когда в клетке есть белки-мишени – ингибиторы синтеза клеточных стенок, как те же β-лактамы, не смогут ингибировать их синтез если не активны. -транспептидазы; блокаторы ДНК-гираз и топоизомераз фторхинолоны – когда нет их мишеней, а есть они в бактериях на стадии размножения.
Но стационарный период развития бактерий – не помеха для лизогенных (умеренных) бактериофагов, которые способны интегрироваться в их геномы и переждать там до активации клеточного цикла или неограниченно долго передаваться всем дочерним клеткам бактерии, реплицируясь в составе их геномов. По сути лизогенные бактериофаги – генетические бомбы замедленного действия, ожидающие подходящего момента, чтобы уничтожить пораженную популяцию или ее часть. Проблема их применения в качестве антимикробных агентов состоит в том, что выход бактериофага из генома требует индукции, как правило – острого клеточного стресса. Таким стрессом может стать взаимодействие с антибиотиками (теми же фторхинолонами или макролидами) или факторами среды (радиация, инсоляция, прогревание), которые угрожают существованию клетки и вируса. В таких условиях вирус активируется и разрушает все клетки, в которых был. Но главная проблема – не индукция, а то, что интегрированные в геном бактерифаги, называемые профагами, являются источником устойчивости таких бактерий-хозяев к другим вирусам (через системы предупреждения суперинфекции) а еще – факторами вирулентности, поскольку именно инфицирование вирусом превращает апатогенный штамм бак в патогенном.
Некоторые бактериофаги содержат в своих геномах гены субъединиц токсинов, в основном генов А-субъединицы, но некоторые бактериофаги, такие как CTXφ Vibrio cholerae, фаг C1 Clostridium botulinum, фаг H-19B Escherichia coli содержат целые кластеры ток. Для вируса изменение поведения хозяина и способность бактерии занимать новые экологические ниши означают появление большего количества пермиссивных клеток, а затем – большие шансы на воспроизводство, что приводит к проблеме, связанной с ростом агрессивности и вирулентности бактерий.
Ввиду этого, когда речь заходит о разработке и внедрении препаратов на основе бактериофагов, появляются серьезные требования относительно того, какие вирусы использовать и будут ли эти препараты безопасны. Ответ – будут, поскольку на нынешнем этапе развития биотехнологий и диагностических систем создатели этих препаратов могут отслеживать опасные кластеры генов.
Современные препараты бактериофагов – это смеси нескольких различных вирусов, специфических либо к конкретному возбудителю (моновалентные), либо к группе возбудителей (поливалентные). Лучшим кандидатом на роль агента фаготерапии является политический поливалентный вирус со значительной скоростью воспроизведения и адаптивностью к изменениям хозяина. Получить такой можно двумя способами – путем произвольного подбора бактериофага из существующей коллекции изолятов или путем прямого выделения бактериофага из популяции бактерии-хозяина. Уникальность бактериофагов обусловлена тем, что они всегда представлены в местах проживания своих владельцев. Задача биотехнолога/вирусолога/микробиолога – выделить вирус и исследовать его на безопасность, а именно:
- Способность лизировать/лизогенизировать бактерию;
- Отсутствие генов токсинов/их субъединиц в геноме;
- Отсутствие других вредоносных генов (антибиотикорезистентности, фазовой вариантности);
- Способность блокировать выделение эндотоксинов перед лизисом клеток.
В настоящее время проверить это можно путем проведения анализа ДНК вируса на известные маркеры подобных групп генов. Если вирус не содержит опасных генов, его можно использовать после лабораторного тестирования. Важным параметром при создании фаговых препаратов является стойкость вирусов, влияющая на срок хранения коктейля, ведь речь идет о целостных биологических объектах, а не химических соединениях. Большинство бактериофагов очень устойчивы и выживают везде, где живут их бактерии-хозяева, не зависимо от температуры, рН и осмотичности среды.
Важным требованием к композиции смеси является не слишком большое количество различных фагов, поскольку они – ультраконкурентные вирусы, которые будут соревноваться за бактерию-хозяина, уничтожая друг друга, а не возбудителя болезни. Также эти вирусы должны преодолевать системы защиты, созданные интегрированными в геном бактерии вирусами, иначе эффективность препарата будет низкой и не длительной.
Технология получения фагосмесей отработана и существует много сертифицированных производств подобных препаратов в разных странах, включая Украину. Сейчас фаготерапия переживает второй Ренессанс – направление развивается стремительно и каждый год появляются все новые и новые компании, предлагающие смеси бактериофагов, но это только первый этап развития этого терапевтического направления. Второй – биотехнологически модифицированные вирусы, по сути не вирусы, а самовоспроизводимые биопрепараты: это бактериофаги с измененными геномами, задача которых – не воспроизводить полноценные вирионы, а распространять инфекционную ДНК в составе рецептор-связывающих белковых телец. Подобные химеры уже тестируют лабораторно и показывают значительную эффективность в противодействии бактериозам. Кроме того, вирусы служат источником новых антибактериальных веществ, обладающих антибиотикоподобной активностью, хотя по сути являются вирусными белками, размноженными в биореакторах. Сюда можно отнести лизоцимы – ферменты (экзо- и эндомурамидазы), растворяющие клеточные стенки бактерий, а также протеиновые антибиотики – бактериоцины, ингибирующие синтез клеточных стенок бактерий, вроде пенициллина, но по природе низкомолекулярные.(пептид Е в фаге φX174, L фагов MS2⁄GA, A2 фагов Qβ⁄SP). Третий путь – сочетание бактериофагов и антибиотиков для усиления эффективности обеих составляющих препарата или одного.
Фаготерапия – «новое-старое» активно развивающееся оружие против бактериозов и от того, как медицинское и научное сообщество будут реагировать на его развитие, будет зависеть его успех в разных странах. Украине удалось иметь собственные разработки фаговых препаратов и замкнутый цикл производства, однако если мы хотим конкурировать на рынке в будущем – должны активнее развивать это направление и не бояться быть в авангарде внедрения альтернативного метода лечения бактериальных инфекций, поскольку несвоевременная реакция на инновации в этой области может привести до утраты возможностей создания наследия собственных научных разработок и поддержания реноме научно реципиента, устойчиво держащегося уже несколько десятилетий. Специалисты центра лечения бесплодия «Medical Plaza» выступают за персонализированную медицину, отечественные инновационные разработки и поддержку украинской научно-технической отрасли. Мы активно применяем и апробируем эту технологию в нашем центре, предлагаем нашим пациентам применять бактериофаги для комплексного лечения хронических и острых бактериальных инфекций, расширяем технологические возможности отечественных производителей, создавая запрос на новые фаговые смеси и препараты. Все это позволит Украине достойно конкурировать на рынке препаратов по борьбе с бактериальными инфекциями и создавать тренды в этой области, а не двигаться только в фарватере мировой науки и персонализированной медицины.
ВЫВОДЫ: Фаготерапия – перспективное направление борьбы с лечением бактериозов, что является альтернативой антибиотикотерапии, к которой у многих пациентов уже сформировалась резистентность. Экологическая и эволюционная лабильность вирусов позволяет быстро подбирать новые виды и компоновать новые фаговые смеси, применяемые в различных протоколах лечения. Возможность создания индивидуальных препаратов на основе вирусов позволит значительно расширить возможности персонализированной медицины, что является значительным шагом врачебной практики в XXI веке.